Resumo As hemoglobinas do peixe que respira ar Synbranchus marmoratus apresentam componentes múltiplos e demonstram polimorfismo. Foi comparado o equilíbrio de oxigênio com células completas e hemoglobina Isolada. Há um efeito Bohr alcalino considerável e este é mais marcado em hemoglobina fracionada à qual tem sido adicionado 1 mM ATP. Foram estudadas as cinéticas de dissociação de oxigênio da combinação de oxiemogloblna e monóxido de carbono, apresentando cursos de tempo cinético surpreendentemente uniformes para um sistema composto de componentes múltiplos. Estes resultados são discutidos dentro do contexto das exigências do animal em um meio ambiente aquático-aéreo misto.

Summary The haemoglobin of the South American lungfish Lepidosiren paradoxa has a single component. The equilibria of this respiratory protein with oxygen have been investigated both In the blood and with the purified haemoglobin. There is a substantial, normal, alkaline Bohr effect and marked sensitivity to organic phosphates in the haemoglobin solutions. Studies on the pH dependence of the kinetics of oxygen dissociation can be interpreted in terms of a normal Bohr effect. The kinetics of combination of carbon monoxide have an unusual pH dependence. These findings are discussed in terms of the two state model of Monod, Wyman and Changeux (1965).

Resumo Têm sido estudados os efeitos de pH e fosfatos orgânicos no equilíbrio e propriedades cinéticas na união de ligantes das hemoglobinas de dois peixes relacionados à Amazônia, Osteoglossum bicirrhosum de respiração branquial obrigatória e Arapaima gigas, de respiração aérea obrigatória. As hemoglobinas de ambos os peixes exibem, um efeito Root, a mínima afinidade pelo oxigênio esta associada com a completa perda da cooper atividade na união do ligante. Nesta baixa afinidade, estado T, há uma grande heterogeneidade das unidades de ambas as hemoglobinas como é evidenciado pelo coeficiente de Hill menor a, unidade e a cinética bifásica na combinação de monóxido de carbono. A maior diferença nas propriedades das hemoglobinas destes dois peixes é encontrada a pH altos (acima de pH 8) onde ambas as hemoglobinas exibem sua mais alta afinidade pelo ligante. Aqui ambas as hemoglobinas diferem em sua afinidade e cooperatividade com a qual elas se unem a seus ligantes, tendo a hemoglobina de Arapaima a menor afinidade porém a mais alta cooperatividade.

Summary The effects of pH and organic phosphate on the equilibrium and kinetic properties of the binding of ligands to the hemoglobins of two related Amazonian fish, Osteoglossum bicirrhosum, an obligate water breather, and Arapaima gigas, an obligate air breather, have been studied. The hemoglobins of both fish exhibit a Root effect, and the minimum oxygen affinity is associated with the complete loss of cooperative ligand binding. In this low affinity, T state, there is great subunit heterogeneity in both hemoglobins as evidenced by Hill coefficients well below unity and biphasic carbon monoxide combination kinetics. The greatest difference in the properties of the hemoglobins of these two fish is found at high pH (above pH 8) where both hemoglobins exhibit their highest ligand affinities. Here the hemoglobins differ both in the affinity and cooperativity with which they bind ligands, Arapaima hemoglobin having the lowest affinity but the highest cooperatively.

Resumo Os hemolisados isolados das arraias da Amazônia, Potamotrygon sp., são heterogêneos. Seus pesos moleculares aparentes, determinados pela filtração em gel, variam de 54.000 - 58.000. Os experimentos de filtração em gel do ferro e ferrilhemoglobina mostram que todos os hemolisados são tetrámeros, os quais não se polimerizam sob oxidação. Um efeito Bohr é evidente em experimentos de equilíbrio de oxigênio de sangue total e de hemolizados. O P1/2 dos hemolisados fracionado diminui 33 vezes entre pH 5,95 — 9,0. Nem NaCl nem uréia em concentrações até 4 M afetam significativamente a afinidade de oxigênio do hemolisado fracionado. A hemoglobina mostra um comportamento cooperativo. Os valores "n", determinados pela equação de Hill, caem dentro da faixa de 1,0 — 1,6 entre pH 6,0 — 9,0. As cinéticas de dissociação de O2 e combinação de CO foram medidas pelo espectrofotómetro "stopped flow" e de "flash photolysis" respectivamente. A velocidade de dissociação de oxigênio diminui e a velocidade de combinação com monóxido de carbono aumenta com o aumento de pH, mudando aproximadamente em quatro vezes entre pH 6,3 — 8,8. A velocidade de dissociação de oxigênio é também sensível ao fosfato, aumentando cerca de 22% na presença de ATP 1 mM a pH 6,3. Os experimentos de desnaturação de uréia indicam que a hemoglobina de Potamotrigonide é mais estável em concentrações elevadas de uréia do que as de outros elasmobrânqulos e teleósteos, sendo apenas 50% desnaturados em concentrações de uréia maiores que 9 M. A afinidade de oxigênio do sangue é mais elevada do que as previamente registradas para muitas espécies de arraias marinhas (P50 = 12 mm Hg a 30°C na ausência de CO2).

Summary The hemolysates isolated from Amazonian stingrays, Potamotrygon sp. are heterogeneous. Their apparent molecular weights, determined by gel filtration, vary from 54,000 - 58,000. Gel filtration experiments of ferro and ferrihemoglobin show that all of the hemolysates are tetramers which do not polymerize upon oxidation. A Bohr effect is evident in oxygen equilibrium experiments of whole blood and of hemolysates. The p1/2 of stripped hemolysates decreases 33-fold between pH 5.95 — 9.0. Neither NaCl nor urea in concentrations up to 4 M significantly affect the oxygen affinity of the stripped hemolysate. The hemoglobin shows cooperative behavior. The n values, determined by the Hill equation, fall within the range 1.0 — 1.6 between pH 6.0 — 9.0, The O2 dissociation and CO combination kinetics were measured by stopped flow spectrophotometry and flash photolysis respectively. The oxygen dissociation rate decreases and carbon monoxide combination rate increases with increasing pH both changing over four-fold between pH 6.3 — 8.8. The oxygen dissociation rate is also phosphate sensitive, increasing approximately 22% in the presence of 1 mM ATP at pH 6.3. Urea denaturation experiments indicate that Potamotrygonid hemoglobin is more stable at high urea concentrations than those of other elasmobranchs and teleosts, being only 50% denatured at urea concentrations greater than 9 M. The oxygen affinity of the blood is higher than those previously reported for many species of marine rays and skates p50 = 12 mm Hg at 30°C in the absence of CO2).

Resumo Examinamos a afinidade pelo oxigênio do sangue total e intacto de representantes de 40 gêneros de peixes da Amazônia. Foram considerados todos os peixes de respiração aérea e branquial e nenhuma diferenciação na afinidade pelo oxigênio pode ser distinguível, embora nos dois casos de espécies próximas i, e. Osteoglossum de respiração branquial versus Arapaima de respiração aérea e Hoplias de respiração branquial versus Hoplerythrinus de respiração aérea; os de respiração aérea têm o sangue com mais afinidade pelo oxigênio do que os de respiração branquial. Significativas diferenças na afinidade pelo oxigênio foram encontradas quando foram considerados o habitat dos peixes: as afinidades pelo oxigênio foram em geral correlacionadas com o oxigênio disponível no meio ambiente e as demandas relativas de oxigênio dos peixes.

Summary We have examined the oxygen-affinity of the fresh, whole blood from representatives of 40 genera of Amazonian fishes. When all the air breathnig fishes and all the water breathing fishes were considered, no differentiation in oxygen affinity could be distinguished, although in two cases of closely related species i.e. Osteoglossum, a water breather, versus Arapaima, an air breather, and Hoplias, a water breather, versus Hoplerythrinus, an air breather; the air breathers have bloods with lower oxygen affinity than do the water breathers. Significant differences in the oxygen affinity were fround when fishes were considered by habitat: the oxygen affinities were in general correlated with available environmental oxygen and relative oxygen demand of the fishes.

Resumo Foram isoladas duas hemoglobinas de um peixe caracídeo, Mylossoma sp. O componente eletroforético de maior migração anódica constitui 89% do hemolisado total. As duas hemoglobinas nativas têm peso molecular aparente de 57.000 por cromatografia em gel. Os pesos moleculares aparentes das subunidades desnaturadas são 14.000 por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio. Não ocorre polimerização depois da oxidação com ferrocianeto de potássio. O estudo da união de oxigênio indica que o componente mais "anódico" da hemoglobina possui um efeito Root. Em pH 5,9 na presença de 1 mM ATP a hemoglobina fica saturada apenas 45% quando equilibrada com ar a 1 atmosfera. O componente mais anódico possui um efeito Bohr normal que é aumentado em presença de 1 mM ATP. A cooperatividade, determinada por n na equação de Hill, varia com o pH. No pH 6,7 e abaixo deste na presença de 1 mM ATP, n < 1. A presença de 1 mM ATP causa uma redução em n em pH abaixo de 8,2. O comportamento menos anódico evidencia um comportamento muito diferente tendo um efeito Bohr reverso Δ log P1/2/Δ pH=0,14, entre pH 7,0 e 8,0 o qual muda para um efeito Bohr normal, Δ log P1/2/Δ pH= —0,13 com adição de 1 mM ATF. Esta hemoglobina mostra cooperatividade em todos os valores de pH estudados. Não mostra efeito Root. Estudos de cinética rápida da ligação CO e da dissociação do O2dos componentes isola dos da hemoglobina mostraram que ambos processos são dependentes do pH para cada componente. Estes resultados são consistentes com as análises dos dados de equilíbrio do oxigênio. As hemoglobinas de Mylossoma sp. se assemelham às de Hoplosternum, truta, salmão, remora e cadozete, no grau de sua diferenciação funcional e podem representar especializações evolutivas designadas para servir funções fisiológicas diversas.

Summary The two hemoglobins of a characid fish, Mylossoma sp. have been isolated. The more anodally migrating electrophoretic component constitutes 89% of the total hemolysate. The two native hemoglobins have apparent molecular weights of 57,000 by gel chromatography. The apparent molecular weights of the denatured subunits are 14,100 by sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis. No polymerization occurs after oxidation with potassium ferricyanide. Oxygen binding studies indicate that the more anodal hemoglobin component possesses a Root effect. At pH 5.9 in the presence of 1 mM ATP the hemoglobin is only 45% saturated when equilibrated with air at one atmosphere. The more anodal component possesses a normal Bohr effect which is enhanced in the presence of 1 mM ATP. The cooperativity, as determined by n of the Hill equation varies with pH. At and below pH 6.7 in the presence of 1 mM ATP, n< 1. The presence of 1 mM ATP causes a reduction in n below pH 8.2. The less anodal component evinces very different behavior having a reverse Bohr effect a log p1/2Δ/ pH=0.14, between pH 7.0 and 8.0 which changes to a normal Bohr effect, Δ log p1/2/Δ pH = — 0.13 upon addition of 1 mM ATP. This hemoglobin shows cooperativity, at all pH values studied. It does not show a Boot effect. Rapid kinetic studies of CO binding and O2 dissociation of the isolated hemoglobin components show that both processes are pH dependent for each of the components. These results are consistent with the analysis of the oxygen equilibrium data. Mylossoma hemoglobins resemble those of Hoplosternum, trout, salmon, sucker and loach in the degree of their functional differentiation and may represent evolutionary specializations designed to serve diverse physiological functions.

Resumo A hemoglobina do bagre da Amazônia Pseudodoras sp. foi isolada e caracterizada; ela compreende um componente único. A composição da subunidade da hemoglobina é similar à de outras hemoglobinas de teleósteos. O peso molecular nativo aparente determinado pela filtração em gel é 66.000. O peso molecular aparente da subunidade é 14,300 por eletroíorese de diodecil sulfato de sódio. A hemoglobina não polimeriza após a oxidação por ferricianeto de potássio. A hemoglobina não apresenta efeito Root. Um pequeno efeito Bohr é evidente na hemoglobina livre de fosíato: Δ log P1/2/Δ pH não é mais do que cerca de -0.1 a -0.2, e aumenta para Δ log P1/2/Δ pH= -0.4 na presença de 1 mM ATP. A cooperatividade determinada pelo n da equação de Hill é baixa, variando de 0.8 para 1.7, entre os pH 6.1 e 8.6. Os valores de P1/2 das soluções de hemoglobina fracionada são extremamente baixos, menos que 0,5mm Hg, em todos os valores de pH examinados entre 6,1 e 9,0, A alta afinidade do oxigênio é refletida principalmente na velocidade de combinação de CO, que se assemelha às encontradas nas mioglobinas e nas subunidades isoladas da hemoglobina humana. Tanto a velocidade da combinação de CO quanto a velocidade da dissociação de O2 determinada por espectrofotometria de "stopped flow", são sensíveis ao pH e ao fosfato. Entre os pH 6,2 e 8,1, a velocidade de COon aumenta cerca de 5 vezes na hemoglobina livre de fosfato. A adição de 1 mM ATP causa uma depressão na velocidade em todos os valores nos pH examinados. A velocidade de O2off diminui 7 vezes, desde pH 6,0 ao pH 8,2, nas soluções de hemoglobina fracionada. A adição de 1 mM ATP induz uma diminuição de 10 vezes através da mesma escala. Nos valores de pH abaixo de 6,0, ocorre uma depressão na velocidade de 02off na hemoblobina fracionada o que indica um efeito Bohr ácido.

Summary The hemoglobin of the Amazonian Catfish Pseudodoras sp. was isolated and characterized; it comprises a single component. The hemoglobin's subunit composition is similar to that of other teleost hemoglobins. The apparent native molecular weight as determined by gel filtration is 66,000. The apparent subunit molecular weight is 14,300 by sodium dodecyl sulfate electrophoresis. The hemoglobin does not polymerize after oxidation by potassium ferricyanide. The hemoglobin lacks a Root effect. A small Bohr effects is evident in the phosphate free hemoglobin: Δ log p1/2 /ΔpH is no more than about —0.1 to —0.2 and increases to Δ 1og 1/2 /ΔpH — —0.4 in the presence of 1 mM ΔTP. The cooperativity, as determined by n of the Hill equation, is low, varying from 0.8 to 1.7 between pH 6.1 and 8.6. The p 1/2 values of stripped hemoglobin solutions are extremely low, less than 0.5 mm Hg at all pH values examined between pH 6.1 and 9.0. The high oxygen affinity is reflected primarily in the CO combination rate with resembles that found in myoglobins and isolated subunits of human hemoglobin. Both the CO combination rate and the O2 dissociation rate determined by stopped flow spectrophotometry are pH and phosphate sensitive. Between pH 6.2 and 8.1 the COon rate increases about 5-fold in the phosphate-free hemoglobin. Addition of 1 mM ATP causes a depression in the rate at all pH values examined. The Ooff rate decreases 7-fold going from pH 6.0 to 8.2 is stripped hemoglobin solutions. Addition of 1 mM ATP inducesa ten-fold decrease over the same range. At pH values below 6.0 a depression in the Ooff rate occurs in the stripped hemoglobin, indicative of an acid Bohr effect.